一、無(wú)色片
染色結(jié)束后，切片中見(jiàn)不到任何陽(yáng)性信號(hào)。這是常規(guī)工作中比較常見(jiàn)的現(xiàn)象，出現(xiàn)這種現(xiàn)象，有兩種可能：
1、真陰性結(jié)果：整個(gè)染色過(guò)程沒(méi)有出現(xiàn)問(wèn)題，組織或細(xì)胞確實(shí)不表達(dá)與抗體相關(guān)的抗原。
2、假陰性結(jié)果：即此陰性結(jié)果不是真實(shí)的反映。假陰性結(jié)果又可分為兩種情況：（1）切片中根本就不包含所預(yù)期檢查的組織或細(xì)胞。出現(xiàn)這種情況，要麼是選擇錯(cuò)了切片、抗體或蠟塊。獲得正確的切片進(jìn)行染色是獲得正確結(jié)果的前提。（2）染色過(guò)程中的某一或某些環(huán)節(jié)出了問(wèn)題。比如，組織未進(jìn)行抗原修復(fù)，有的組織必須經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)才能檢測(cè)抗原表達(dá)；或選用了只能用于冰凍組織而不能用于石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效，雖然抗體失效在理論上是一個(gè)逐漸的過(guò)，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長(zhǎng)期不用和/或已超過(guò)有效期是主要的原因。也可見(jiàn)于染色過(guò)程中漏掉了某一環(huán)節(jié)，如忘記加二抗或三抗，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配制DAB時(shí)少了過(guò)氧化氫。為了避免這種簡(jiǎn)單的錯(cuò)誤，有一種簡(jiǎn)單的方法：在三抗孵育結(jié)束時(shí)，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配制好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現(xiàn)棕色。如果出現(xiàn)了，證明三抗和DAB的配制過(guò)程沒(méi)有錯(cuò)誤。如果這種DAB再滴到切片上沒(méi)有出現(xiàn)任何陽(yáng)性信號(hào)，問(wèn)題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現(xiàn)棕色反應(yīng)，問(wèn)題肯定在三抗或DAB的配制過(guò)程。這種簡(jiǎn)單方法能迅速的幫助我們查找出現(xiàn)問(wèn)題可能的原因。
二、“雜音"染色片
免疫組化除正常的真實(shí)的陽(yáng)性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音"染色?！半s音"染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說(shuō)明，以下將其歸納為下面幾種。
1、全片著色
全片著色是指整個(gè)切片全都染上了顏色，著色的強(qiáng)度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽(yáng)性那些組織是陰性。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
（1）抗體濃度過(guò)高：一抗?jié)舛冗^(guò)高是常見(jiàn)的原因之一。解決辦法是，每次使用新抗體前應(yīng)當(dāng)對(duì)其工作濃度進(jìn)行測(cè)試，使每一抗體個(gè)體化，找到適合自己實(shí)驗(yàn)室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此，不能只簡(jiǎn)單的按說(shuō)明書進(jìn)行染色。
（2）抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度較高：解決辦法是，嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)程，最好隨身佩帶報(bào)時(shí)表或報(bào)時(shí)鐘，及時(shí)提醒，避免因遺忘而造成時(shí)間延長(zhǎng)。現(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時(shí)間不是傳統(tǒng)的1小時(shí)，而是30分鐘，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。
（3）DAB變質(zhì)和顯色時(shí)間太長(zhǎng)：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進(jìn)行過(guò)濾后再用。配制好的DAB不應(yīng)存放時(shí)間太長(zhǎng)，因?yàn)樵跊](méi)有酶的情況下，過(guò)氧化氫也會(huì)游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達(dá)到理想的染色程度時(shí)立即終止反應(yīng)。不過(guò)當(dāng)染色片太多時(shí)或用染色機(jī)時(shí)，這樣做似乎不現(xiàn)實(shí)，但至少應(yīng)對(duì)一些新的或少用的抗體顯色時(shí)進(jìn)行監(jiān)控，避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
（4）組織變干：修復(fù)液溢出后未及時(shí)補(bǔ)充液體、染色切片太多、動(dòng)作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因。
（5）切片在緩沖液或修復(fù)液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（大于24小時(shí)）：原因上不清楚，但現(xiàn)象存在。有的實(shí)驗(yàn)室喜歡前一天將切片脫蠟至修復(fù)，第二天加抗體進(jìn)行免疫組化染色，如果將裝有切片和修復(fù)液的容器放在4度冰箱過(guò)夜，對(duì)結(jié)果無(wú)明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會(huì)出現(xiàn)背景著色，因此，不可存放時(shí)間太長(zhǎng)。
（6）一抗變質(zhì)、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過(guò)期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時(shí)最好設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和用使用過(guò)的抗體作比較。
2、切片邊緣著色
切片邊緣著色也是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：
（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。
（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。
3、“陰陽(yáng)臉"著色
指組織一半著色一半無(wú)著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開(kāi)而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑完w全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開(kāi)使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開(kāi)始試劑已全部覆蓋了組織，但后來(lái)試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對(duì)于這種問(wèn)題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。
4、灶片狀著色
切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問(wèn)題的原因有：
（1）裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過(guò)深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺(tái)不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)。
（2）壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。
（3）制作APES膠片時(shí)，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時(shí)、熱水沖洗玻片1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鐘、玻片過(guò)一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過(guò)一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37度過(guò)夜干燥、室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ绻破^(guò)程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當(dāng)加入一些丙酮。
5、間質(zhì)著色
著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是lambda和kappa染色時(shí)。當(dāng)甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí)，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)著色。抗體不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色，我們?cè)龅紺D20抗體不純，除了染上B細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。
6、細(xì)胞漿著色
胞漿著色是所有“雜音"染色中最j具有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無(wú)著色，看上去與真實(shí)的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見(jiàn)于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過(guò)血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色，如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）、過(guò)氧化氫酶（肝、腎），這些可用過(guò)氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過(guò)形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物s素的著色最j具有欺騙性，因?yàn)樗鼜V泛的存在于組織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物s素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物s素被封閉，加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物s素暴露，內(nèi)源性生物s素暴露的強(qiáng)度在不同的組織有所不同，從弱陽(yáng)性（+）到強(qiáng)陽(yáng)性（+++），內(nèi)源性生物s素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內(nèi)源性生物s素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源性生物s素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物s素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物s素可被雞蛋清封閉，非生物s素檢測(cè)系統(tǒng)Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物s素干擾。
7、細(xì)胞核著色
不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲/苯里浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)、組織變干、微波修復(fù)液的pH值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過(guò)程中修復(fù)液留下得太少，未沒(méi)過(guò)組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工作。免疫組化除正常的真實(shí)的陽(yáng)性信號(hào)外常常會(huì)遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音"染色?！半s音"染色種類繁多，產(chǎn)生的原因也多種多樣，為了便于說(shuō)明，以下將其歸納為下面幾種。
1、切片邊緣著色
切片邊緣著色也是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象稱為邊緣效應(yīng)。產(chǎn)生的原因：（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下面試劑洗盡所致。解決辦法：制備優(yōu)質(zhì)的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片，不厚于4微米，組織的前期處理應(yīng)規(guī)范，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變干，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應(yīng)超出組織邊緣2mm。
2、間質(zhì)著色
著色部位主要在間質(zhì)，間質(zhì)著色的原因很多，如抗體與組織中的蛋白質(zhì)因蛋白疏水基團(tuán)相互作用形成非特異性的連接而著色，加一抗前的血清封閉這一步就是為了避免非特異型的結(jié)合。又如血清中的免疫球蛋白常常滲出到組織間質(zhì)，很容易與抗體結(jié)合，造成間質(zhì)著色，特別是lambda和kappa染色時(shí)。當(dāng)甲狀腺膠質(zhì)外溢到組織間質(zhì)時(shí)，做甲狀腺球蛋白染色也會(huì)出現(xiàn)間質(zhì)著色?？贵w不純或抗體被污染也可出現(xiàn)間質(zhì)著色，我們?cè)龅紺D20抗體不純，除了染上B細(xì)胞外還染上了間質(zhì)。
3、“陰陽(yáng)臉"著色
指組織一半著色一半無(wú)著色，形成交界清晰或不甚清晰的兩種染色結(jié)果。其成因是試劑僅覆蓋了部分組織而不是全部。如加試劑后未讓試劑流散開(kāi)而集中在部分組織上。通常應(yīng)該在加完試劑后，仔細(xì)看一遍，是否有的組織未被試劑完w全覆蓋，如有這種情況，建議用牙簽而不是用吸頭或試劑瓶口將試劑引流開(kāi)使之將組織全部覆蓋。另外，染片盒不平，切片傾斜，雖然開(kāi)始試劑已全部覆蓋了組織，但后來(lái)試劑流向一邊，部分組織未被試劑覆蓋。對(duì)于這種問(wèn)題，只要留心或想到了很容易發(fā)現(xiàn)，也很容易解決。
4、灶片狀著色
切片中著色區(qū)東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現(xiàn)這種問(wèn)題的原因有：（1）裱片時(shí)水未排盡，在局部形成氣泡使組織突起，染色時(shí)試劑滲入后不易洗盡，顯色過(guò)深所致。解決辦法是，漂片盒里的氣泡應(yīng)去盡，晾片熱臺(tái)不能平放，應(yīng)有45度左右的斜度，利于水流走和蒸發(fā)（2）壞死組織灶，組織壞死后細(xì)胞破壞、酶的釋放、蛋白游離、分解，復(fù)雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結(jié)合導(dǎo)致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時(shí)應(yīng)避免選擇壞死組織較多的切片。（3）制作APES膠片時(shí)，膠的濃度太高，干燥后在玻片上留下白色小點(diǎn)，顯色時(shí)白色小點(diǎn)著色。解決辦法是按照標(biāo)準(zhǔn)的制備方法進(jìn)行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時(shí)、熱水沖洗玻片1小時(shí)、蒸餾水洗玻片1分鐘、丙酮浸泡玻片5秒鐘后空氣干燥（室溫）、2%APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鐘、玻片過(guò)一下丙酮（1-2秒鐘）、玻片過(guò)一下蒸餾水（1-2秒鐘）、37度過(guò)夜干燥、室溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｈ绻破^(guò)程中，因丙酮逐漸揮發(fā)而膠變濃時(shí)可適當(dāng)加入一些丙酮。
5、細(xì)胞漿著色
胞漿著色是所有“雜音"染色中最j具有欺騙性的著色，著色區(qū)局限在細(xì)胞內(nèi)，間質(zhì)無(wú)著色，看上去與真實(shí)的免疫反應(yīng)著色幾乎一樣，很難區(qū)別。胞漿里含有較多的蛋白質(zhì)，因此，很多非特異性的染色除了見(jiàn)于間質(zhì)也可以出現(xiàn)在胞漿中。這種原因造成的著色，可以通過(guò)血清封閉解決。還有因內(nèi)源酶造成的著色，如血紅蛋白（紅細(xì)胞）、肌紅蛋白（肌細(xì)胞）、細(xì)胞色素（粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）、過(guò)氧化氫酶（肝、腎），這些可用過(guò)氧化氫進(jìn)行封閉。巨噬細(xì)胞吞噬各種抗原物質(zhì)或Fc片斷而出現(xiàn)胞漿著色，這種著色不易避免，但可以通過(guò)形態(tài)學(xué)辨認(rèn)出巨噬細(xì)胞而引起重視。內(nèi)源性生物s素的著色最j具有欺騙性，因?yàn)樗鼜V泛的存在于組織細(xì)胞中，我們研究結(jié)果顯示：冰凍組織中存在內(nèi)源性生物s素，經(jīng)福馬林固定石蠟包埋后生物s素被封閉，加熱抗原修復(fù)后造成內(nèi)源性生物s素暴露，內(nèi)源性生物s素暴露的強(qiáng)度在不同的組織有所不同，從弱陽(yáng)性（+）到強(qiáng)陽(yáng)性（+++），內(nèi)源性生物s素在組織中的分布形式，既有散在分布也有彌漫分布，主要以顆粒狀形式存在于胞漿中，內(nèi)源性生物s素廣泛存在于上皮源性組織，特別是腺上皮組織，亦存在部分非上皮組織，內(nèi)源性生物s素不僅存在人體組織也存在大鼠組織，內(nèi)源性生物s素暴露的強(qiáng)弱與修復(fù)液有關(guān)，其強(qiáng)度增加依次為：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修復(fù)暴露的內(nèi)源性生物s素可被雞蛋清封閉，非生物s素檢測(cè)系統(tǒng)Polymer兩步法（EliVision、EnVision）可避免生物s素干擾。
6、細(xì)胞核著色
不適當(dāng)?shù)慕M織處理可以出現(xiàn)細(xì)胞核著色，如組織在二甲/苯里浸泡時(shí)間太長(zhǎng)（如從星期五浸泡到下星期一）、緩沖液中浸泡時(shí)間太長(zhǎng)、組織變干、微波修復(fù)液的pH值和修復(fù)時(shí)間不當(dāng)或修復(fù)過(guò)程中修復(fù)液留下得太少，未沒(méi)過(guò)組織等。解決辦法是嚴(yán)格按照操作常規(guī)進(jìn)行工。
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